Virološki studija. Crijevnih bolesti. (Dio 4)

Primjena RKOA paralelno sa IFA i RAL pokazala blisku metode korelacije koriste rezultati (Zhang Y. et al., 1989 Pereira V. et al., 1992- Jap K. et al., 1992). Međutim, postoje podaci o izgledu nespecifičnih reakcija kopromaterialami, koja se može ukloniti adsorpcijom prije suspenzije stafilokoka. U isto vrijeme, bez obzira na podudarnost rezultata istraživanja materijala RKOA i IFA, njegova osjetljivost i specifičnost bila je niža nego u ELISA, i može porediti sa lateks aglutinacije (Jap K. et al., 1992).

Prema tome, rezultati RKOA dopustiti da ga preporučiti za dijagnozu rotavirus infekcije u laboratorijama u kojima ne postoji mogućnost korištenja više osjetljive i specifične metode. Međutim, nedavno je testiran u modifikaciju RKOA i radioimmunoprecipitation sa proteinima A Staphylococcus aureus je značajno poboljšati osjetljivost i specifičnost testa i za proučavanje imunološkog odgovora na VP2, VP6 i nSP2 u serumu i kopromaterialah djece s RV infekcija (Colomina I. et al., 1998) .

lateks reakcija aglutinacije (RAL) koji se koristi u laboratoriju praksi zbog napora u posljednjih nekoliko godina tendenciju da koriste kao nosioci antigena i antitijela inertni sintetičkih materijala. Za tu svrhu koristi polistiren kaučuka - standardna sintetičkih veličine globula čestica oko 0,8 mikrona. Manje čestice veličine (0.2-0.3 um) pohranjen u reakcijama sporo i zahtijeva ultratsentrifugatsii tijekom kuhanja Diag-stikuma, veliki dobro (> 1 mm) često daju nespecifične reakcije. Lateks čestica, prethodno adsorbovana antitijela (antigen), steći sposobnost da se agglutinated u prisustvu homologne antigena (antitijela) i vizualizirati specifičnim antitijelo-antigen kompleksa. Da bi se poboljšala specifičnost i osjetljivost čestica lateksa mogu biti senzibilizirani imunoglobulina (Amer A. et al., 1990). Zbog jednostavnosti i brzine studije, kao i niski troškovi lateks-aglutinacije koriste u laboratorijskoj praksi vrlo široko: Ruggeri F. et al 1992 ..

Trenutno, uređen proizvodnja komercijalnih test sistema za lateks aglutinacije, što je osnova za rad na komparativnu evaluaciju njihove dijagnostičke efikasnosti.

Generalizovani rezultati evaluacije RLA i druge laboratorijske metode su otkrili da osjetljivost i specifičnost RLA u odnosu na TEM, ELISA, EF stranice su dovoljno visoke i jednaka 70-96% i 80-100% čađi sponding (Santos N. et al. , 1989- Molyneaux PJ et al., 1989 Amer A. et al., 1990 Hendricks MK i dr., 1995). Upotreba monoklonskih antitijela je dodatno poboljšan dijagnostičke vrijednosti RLA (Dennehy R. et al., 1988- Zbinden R. et al., 1992- Sanchez R. et al., 1993).

Zajedno s komercijalnim lateks sistema i istraživači koriste laboratorijske testove koji daju rezultate porediti sa njima (Amer A. et al., 1990).

U isto vrijeme, veliki broj autora je istakao da je upotreba RLA nije bez mana, jer daje određeni broj lažno pozitivnih rezultata. Tako je, tokom ispitivanja 200 pacijenata djeca ELISA i otkrivene RLA 11 uzoraka lozhnonegativnyh po stopama jednaka osjetljivost i specifičnost od 86 i 95%, respektivno (Amer A. et al., 1990). Kasnije, drugi autori u anketi od 585 uzoraka stolice bolesne djece RLA i EF STRANA dobili osjetljivost i specifičnost od 96 i 100%, respektivno. Ustanovljeno je 6 lažno negativnih i lažno pozitivan rezultat u 3 Za razliku od Faraday snagu u Naat. (Zbinden R. et al. 1992). Prema Hendricks, MK i dr. ispitivanje 103 djece u dobi 1 mjesec do 5 godina Metode TEM EF stranicu i RLA su pokazali da je osjetljivost od ovih metoda je jednaka 84, 90 i 80%, a specifičnost od 100, 100 i 81% respektivno. Autori su našli 15% lažno pozitivnih rezultata u skladu RLA (Hendricks M. K. et al., 1995) koji se mogu povezati sa rota-virusnih gastroenteritisa krvlju u ispitivanom materijalu. U tom smislu, priprema pozitivne reakcije u RLA s uzorcima koji sadrže krvi, rezultate treba uzeti sa rezervom i potvrđena drugim metodama (Bendall R. et al., 1991).

Dakle, RLA predstavlja najjednostavniji dijagnostičke reakcija detekcije Rotavirusi. Kao vrijedan način za brzu dijagnostiku i posjeduju visok nivo osjetljivosti i specifičnosti ove metode, međutim, nema prednosti u odnosu na ELISA, TEM, EF PAGE, osim za brzinu reakcije i mora se potvrditi drugim metodama.

Sumirajući materijala, treba napomenuti da je cijeli sedimenta testovi su naširoko koristi u laboratorijske dijagnostike rotavirusa infekcije zbog visoke osjetljivosti i brzini dobivanja rezultata, lakoću formulacije i računovodstva, kao i nedostatak potrebe da se koriste sofisticirane opreme i skupe reagense.

Dijagnostičke metode zasnovane na detekciju virusa specifične RNA. Razvoj molekularne tehnike biologije u virusologije dovelo do primjene u praksi velikog broja novih dijagnostičkih testova na osnovu otkrivanje virusne RNK. Njihova upotreba je otvorilo mogućnost pristupa molekularne epidemiologije i pomogao riješiti neke od problema rotavirusa taksonomija. Jedan od prvih dijagnostičkih testova u ovoj grupi bio je elektroforeza gel virusne genoma.

Elektroforeza virusne RNK u poliakrilamid gel elektroforeze (PAGE EF) je dovoljno fleksibilan i široko rasprostranjena, kako u istraživanjima i praktičnim laboratorija. Zbog visoke specifičnost i osjetljivost, on može riješiti niz pitanja vezanih za rotavirus infekcije, i pronalazi koristiti u dijagnostici, epidemiologije i prevencije. Mogućnost primjene ove metode izazvalo jedinstvenu distribuciju obrazac u gel jedanaest virusnog genoma segmentima i visoku stabilnost rotavirusa RNK djelovanjem faktora okoline. Postoji nekoliko verzija EF PAGE. Neznatno razlikuju jedni od drugih, svi su na osnovu ekstrakcije rotavirus RNK, destilacija RNK izolovana poliakrilamid gel elektroforeza pod utjecajem električnog polja i vizualizaciju virusnog genoma rezultate destilacije RNK. Promjene mogu biti u svakoj od tih faza EF PAGE. Dakle, rotavirusom RNK izolacija se može izvršiti direktno iz fecesa, zaobilazeći korak izrade pročišćene virusa- moguće preliminarni odvajanje jednokrevetne i dvokrevetne RNK, 32P administriranje oznaka, obrada materijala sa nukleozu S1, uništava RNK varira struktury- sastav pufera, postotak podjele i koncentracijom gelya- amperaže elektroforeza, bojenje metoda. vrijeme studija je 24-36 sati. Kao rezultat toga, bendova na gel nakon bojenja sa srebro nitrata ili Ethidium-bromo-kuća profili identifikovani virusne RNK koja odgovara 11 segmente genoma virusa (Unicomb L. E. i dr., 1993 Assouli SM i dr., 1995- Bos P. et al., 1995- Vasil'ev B. J. et al., 1995- Szczepaniak Z. et al., 1996 Holmes JH, 1996- Steele AD et al., 1996- Markowska-Daniel J. et al., 1996 Espinoza F. et al., 1997- Adah M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).

U skladu sa standardnim uvjetima elektroforeza na lokaciju segmenata genoma dovoljno stabilna i omogućava da se identifikuju izolata na osnovu svog identiteta foregrammy. Treba napomenuti da je distribucija genoma segmenata na foregramme je genetski otporan osobina i bilo kakve promjene u redoslijedu aminokiselina genoma podrazumijeva mijenja stopu migracije virusnih proteina (Kuzuya M. et al., 1996). Osim toga, priroda foregrammy svojstvena specifična izolat može poslužiti kao sredstvo za dešifrovanje rakete identifikuju načine i izvore zagađenja (Oishi J. et al., 1993 Broor S. et al., 1993 Beque R. et al., 1992). Osim toga, ova metoda dozvoljena Rotavirusi podijeliti u dvije podgrupe sa takozvanim "kratki" ili "dugo" pho-retipami (zbog većeg ili manjeg mobilnost 10 i 11 genoma segmenata) koji je neophodan za klasifikaciju RV stanovništva. Shodno tome, EF stranica može se uspješno koristiti u dijagnostici, epidemiologije i klasifikacije u odnosu na različite metode (RAL, GA, izolacija virusa u staničnoj kulturi) - -method referencu.

Istraživanje koje je provela niz istraživačkih timova su pokazali da EF STRANA ima visoku osjetljivost i specifičnost. Komparativna studija ovih parametara u odnosu na FE PAGE, TEM i RLA vodi sa 103 djece ispitivanja pokazali su da je osjetljivost je 90, 84 i 80%, a specifičnost od 100, 100 i 81% (Hendricks M. K. et al., 1995 ). Analogno podataka, uključujući dodavanje ovih metoda i PCR i IFA su dobijeni i Husain Buesa J. M. Međutim, osjetljivost FE PAGE, prema ovim autorima, nešto inferiorna u odnosu na rezultate PCR i ELISA, ali je specifičnost bila 100% (Husain et M. al., 1995- Buesa J. et al., 1996). Slični rezultati su dobiveni u studijama kontakt fekalija od 50 pacijenata IKP metoda TEM, ELISA i EF stranici. Indikatori pozitivnih nalaza u EF PAGE iznosila je 28% u odnosu na 35% u EIA i EMP-a. Međutim, treba napomenuti da je u tri uzorka, gdje rotavirus otkrivena u TEM nisu bili u skladu sa Faraday efekat u snimljeni foregramma STRANICA karakteristika rotavirusa (Vasil'yev B. J. et al. 1990). Stariji našim istraživanjima na materijalu IKP 510 pacijenata koji koriste ELISA, TEM i EF PAGE, omogućio nam je da potvrdi Rotavit-slojevite etiologije bolesti u 37 i 23%, respektivno (Vasil'yev B. J. et al. 1995).

Maldonado A. et al. (1998) u komparativna studija kopromaterialov djecu u bolnici sa dijarejom, metode EF PAGE i ELISA dokumentirani RV prirode bolesti u 42,7 i 49,5% respektivno.

Treba napomenuti da je pored horizontalna i vertikalna elektroforeza se koristi, što je, prema nekim autorima, može porediti sa horizontalnim specifičnosti i osjetljivosti, ali više jednostavno. Kada držite ga da donese autori predlažu da uključi rezultate bromida-diy direktno na gel i koriste isti gel za nekoliko studija. Oni su također dizajnirani s ultraljubičastim osvjetljenje uređaja, koji omogućuje jednostavan i udoban čitanje foregrammy (Zbinden R. et al., 1992).

Datum vertikalnih elektroforeza metodom vizualizacije foregramm posrebrivanje predložio Giardano M. O. et al. (1997). Njihova nalazi su pokazali da je nova modifikacija osjetljivost, specifičnost, i jeftinije od konvencionalnih FE stranici.

Dakle, FE način PAGE trenutno naširoko koriste u laboratorijama u različitim zemljama za RV dijagnostiku. Brojni komparativnih testova ove metode s TEM, IEM, RAL i ELISA pokazuju visoku specifičnost i osjetljivost, kao i mogućnost korištenja Faraday efekat na strani kao referentna metoda za učenje novih test sistema. Koristeći poliakrilamida gel elektroforeza u cilju identifikacije izvora zaraze i načina njenog širenja, kao i dekodiranje etiologije izbijanja bio je osnova za uspješno rješavanje stvarnih problema molekularne epidemiologije.

transfer proces proteina (Western-blot) ili nukleinske kiseline (Dot-blot ili Northern-blot i Southern-blot) elektroforetske matrice i njihove imobilizacije na čvrstoj fazi površine se zove blotting, a rezultat otiska prsta - upijanje. Kada se analizira blotogramm koristeći imunološki sera tehniku ​​koja se zove imunoblottingu.

Kao sonde obično koriste ili RNK prepisan in vitro na matricu virusnog genoma ili komplementarne DNA klonova dobiti na matricu virusnog genoma pomoću reverzne transkriptaze i naknadne molekularne kloniranja. Ranije sonde označeni izotopa koje 125J ili 32p, ali u posljednjih nekoliko godina je koristio non-radioaktivni etikete - biotin, ili enzima, što znatno pojednostavljuje način jer eliminira probleme izotopa sigurnost (alkalna fosfataza, peroksidaze, itd.). U ovom slučaju rezultati reakcije su snimljene u obliku mrlje boje formirana pod uticajem enzima za podlogu je dodat, ukazuje na to da je sonda hibridizovan RNK virusa u materijalu.