Virološki studija. Crijevnih bolesti. (Dio 5)

Primjeri upotrebe Zapadne-blot za proučavanje strukture proteina RRV-2, SA-11, DS-1 je rad Pavlov i dr. (1991). Primjenom hiperimunog seruma, autori sprovodi imunoblot analizu VP1, VP2, VP4, VP7 - referentna sojeva rotavirusa majmuna i ljudi. Kasnije, Zeng P et al. (1994), koristeći zapadne blot tehnikom, a potom upotrebom monoklonskih antitijela za imuno-blotting, VP2 ispitati funkcije, SA-11, čestica skupština mehanizam VP2, VP2 / 6 i transport metabolita u jezgru.

Najčešći način molekularne hibridizacije je RNK-RNK hibridizacije u Dot-blot, i Northern-mrlja. Dot-blot (dot hibridizacije) je najjednostavniji jedan za molekularnu hibridizacije, omogućavajući kvantifikaciju virusnih nukleinskih kiselina. Northern-blot - varijanta molekularne hibridizacije, pri čemu odvajanje nukleinskih kiselina izvađen iz elektroforetski matrice, se prenosi i imobilizovan na čvrstoj fazi površina u istim redoslijedom kao što su u gel. U isto vrijeme, korištenje Dot-blot'e i Northern-blot'e sonde za određene gene rotavirusa, uključujući VP4 i VP7, omogućava izolati su direktno unose u materijalu pacijenta.

Molekularna metoda hibridizacije se koristi u dijagnostici rotavirus infekcije (Novikova, A. et al., 1991, 1998 Krasko A. G. i dr., 1991 Ginevskii VA i dr., 1992- Fer-nandoz J. et al., 1992- Steele i dr., 1996.-Husain M. et al., 1996), ali češće za zadatke kao što su kucanje izolat studija atipične sojeve interspecies i međugrupnih preraspored, u toku u molekularnoj studija epidemiologije, i interspecijski i međugrupnih preraspored (Gorrell RY i ostali, 1996- Kuzuya M. et al, 1996 Nakagomi 0., Nakagomi T., 1991. (a, C) - .. 1996- Ward R., 1990, 1991 Qian Y. et al., 1991 Palombo E. et al., 1998).

Teorijske mogućnosti primjene mjesto hibridizacije za dijagnozu RV infekcije ljudskim pokazalo Krasko A. G. i dr. (1991). Kao sonde koriste 32P-označeni svinjske RV genoma segmentima prepisan in vitro aktivacijom endogenog RNK-ovisnost Sima RNK polimeraze, a transkripti su dobijeni za svih 11 segmenata RV.

Primjena ove metode pomoću sonde u RNK RV SA-11, također označen sa 32P, dozvoljeno Novikova N. A. i dr. (1991) za otkrivanje RV RNK u nazofarinksa bris od 29 (76,3%) od 38 pacijenata RVGE koji potvrđuje mogućnost RV genoma transkripcija u ćelijama sluznicu nazofarinksa.

RNK-RNK hibridizacije dijagnostička vrijednost je pokazala Fernandoz J. et al. (1992) 303 na inspekcijskih uzoraka stolice od pacijenata RVGE Dot-blot. Oligonukleo tidny-sonda koja se sastoji od 40 područja 33-72 VP7 gen nukleotida, najkonzervativnijih mnoge Rotavirusi. Kao oznaka koristi biotin (biotin-dATP 7). Uz Dot-blot je korišten EF PAGE i ELISA. Tu su identifikovana 230 pozitivnih slučajeva potvrđeno dot hibridizacije i EF stranici. ELISA pokazala manje pouzdani, koji je otkrio 7 lažno pozitivnih i lažno negativnih uzoraka 12. Osjetljivost ove metode je 200 pg (Fernandoz J. et al., 1992). Rezolucija Northern-blot bio veći i dozvoljeno do 6,0 pg otkriti homologna RNK, pri čemu sonde ne reaguju čak i sa 100 ng na heterologne RNK (Ali A. et al., 1993).

Koristeći specifične sonde različitih G- i P-tip je otvorio mogućnost da dobije jasnu sliku cirkulacije rotavirusa u različitim geografskim područjima (Sethabuthz O. et al., 1992- Husain M. et al., 1996- Correll RY et al., 1996 Isa P. et al., 1996- Adah M. et al., 1997).

RNK-RNK hibridizacije je dozvoljeno da dokumentuje prisustvo međugrupnih preraspored, koja se javlja u vivo kao iu uzgoju Rotavirusi pripadaju različitim genogrupe na staničnoj kulturi (Ward R., 1990- 1991).

Ova metoda je također u stanju da preciznije karakterišu pripadnosti određenoj virusa u određenoj grupi. Rotavirus određenih podjela I i II podgrupa u sadašnjoj fazi nije potpuno neistinito, tj. Nisu svi izolati u. Fit "u već dobro poznatim karakteristikama. Na primjer, AU-1 soj ne odgovara karakteristika podgrupe I, što ipak dugo foretipom. Samo korištenje RNK-RNK hibridizacije podataka moguće je identificirati tu vrstu i sličnih ih izoluje u posebnu grupu (Nakagomi O., Nakagomi T. 1991. (a, b) - 1992). Osim toga, RNK-RNK hibridizacije svrstava Rotavirusi na genetskom nivou (tj. N. Genogrouping), što je posebno vrijedan za proučavanje atipičnih rotavirusa izolata (Nakagomi G., 1996).

Osim RNK-RNK hibridizacije pokazuje korištenje RNK-DNK hibridizacije (Južna-blot). komplementarne DNA (DNK) dobijeni su tu svrhu obrnutom transkripcije genomske RNA u različitim segmentima. Dokazano je da se posmatra najefikasniji hibridizacije kada se koristi kao cDNA sonda za segment 3 RV genom. Kao oznaka koristi sa 32P. Efikasnost Dot-blot hibridizacija RNA-DNA je 0,5 ng. U ovoj specijalnoj studija je pokazala da je cDNA sonde koriste ne daju cross-reakcije sa drugim grupama RV RNK (Eiden J. et al., 1989).

Treba napomenuti da je Holding mjesto RNA-DNA hibridizacije za diferenciranje serotipova u prisustvu 50% formamid čini reakcija strogo specifične (Rosen V. et al., 1990). Osim toga, provođenje hibridizacije reakcija je moguće ne samo oligonukleotidi označeni 32P, ali alkalna fosfataza (ALP). Osim toga, korištenje oba markera u studiji od 148 uzoraka RNK-DNK hibridizacije pokazala slične rezultate (Sethabutr O. et al., 1992).

Southern-blot je naširoko koristi u otkrivanju rotavirusa genoma i okoline. Koristeći RNA-DNA hibridizacije RV je otkrivena u vodi za piće, tla, otpadnih voda (Ginevskii VA et al., 1992- Zothikumae N. et al., 1995- Grinde V. et al., 1995- Dubois E . et al., 1997).

Dakle, metode hibridizacije se odlikuju neuporedivo veća osjetljivost i specifičnost od laboratorijskih testova i mogu se uspješno koristiti kao referenca za evaluaciju. Oni su univerzalni način postavljanja dijagnoze i tipizacija rotavirusa i omogućava tipizacija izolata sebe u materijalu od pacijenata.

U posljednjih nekoliko godina, na osnovu najnovijih biotehnologije i genetski inženjering razvili jedinstvenu metodu dijagnosticiranja virusnih zaraznih bolesti pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR). Za razliku od tradicionalne tehnike ELISA izbrisati hibridizacije, osiguravajući pouzdanu detekciju ,1-10.000.000 ciljne molekule (antigena ili nukleinske kiseline), PCR metoda omogućava identifikaciju samo jedan nukleinske kiseline molekula u uzorku.

PCR se temelji na dva osnovna svojstva nukleinskih kiselina - podjeli sintetiziran dvostruko niti genomske DNK i ponovno sinteza na osnovu ovih komplementarnih nukleinskih struktura.

Za reakciju testa uzorak sa proteinazni K i fenol-kloroform izolovani nukleinskih kiselina (Oischi J. et al., 1993 Gouvea V. et al., 1991). U vezi sa potrebom za korištenje otrovnih tvari, kao što su fenol, kloroform, hlorofluorougljikovodika, još metoda je razvijena dvostruko RNK izolaciju i pročišćavanje zasniva na upotrebi Guanidine, i gidrooksiapatita tsetiltri metil-amonijev bromid (Santos N., Gouvea V., 1994) . Metoda je jednostavna, efikasna, omogućava da se oslobodi RNA iz inhibitori enzima, i daje veći prinos od virusne RNK. Denaturisan žarenje (90 ° C) nukleinske kiseline se nalaze u srednje dopunjen prajmera nukleinske kiseline i termostabilne DNK polimeraze. Na 36 "C na posebnom DNK sa DNK polimeraze sintetizira komplementarnu strukturu. Kapisle odrediti koji dio RNA se reproducirati, a dodatak stop kodona rezultata u činjenici da polimerizacije nije cijelom dužinom DNK lanca, a samo jedan dio lanca, koja je odgovorna za određene funkcije genoma, t. E. Gruppo-, tip- ili serospetsificheskie sekvenca gena. Temperatura je zatim podignuta na 58-60 ° C, što je rezultiralo u sintetizovanu dvostruko nit pauze. Temperatura se zatim spušta do 36 ° C, i sintezu komplementarnih lanaca se ponavlja u dva dijela već lanaca i t. D. Kao rezultat čestih ponavljanja ovog postupka, broj strogo specifični za svaki patogen sekvence nukleotida se povećava za nekoliko redova veličine. Teoretski osjetljivost jednostavno ukloniti, kao što je u ovom slučaju od jednog lanca može dobiti 1000 puta akumulacije sekvence nukleotida. Ova metoda ne zahtijeva radioizotopa pretvorio u jedan milion puta osjetljiviji od standardnih metoda sa elektroforeti-dressing dsRNK - genoma segmentima i 5000 puta više osjetljiva tehnika molekularne hibridizacije (Xu L. et al, 1990) .. Prema Eiden J. et al. (1991) PCR osjetljivost u rutinskoj istraživačkim pristupima femtokolichestvam (80 FG).

Treba napomenuti da je kao polazni molekula za PCR se može koristiti u DNA ili cDNA pripremljeni od RNK preko obrnutom predobrade traskrip-tazoy zatim pojačanja. RNK oporavio od oba svježe pripremljenih ćelija, tkiva i smrznute, agenti liofi-rasvjeta ili fiksna, tj. E. objekti prethodno nedostupna za analizu. Ova vrsta je poznata kao PCR revertaznoy natrag reakcija transkriptatsionnoy lančane polimeraze (RT-PCR). Suština ovog modifikacija je da se koristi PCR oligonukleotnyh par početnica sposoban posebno hybridising na sekvence nukleotida na suprotnim krajevima dva DNK lanaca dio. Kao kapisle za simultano sintezu komplementarne grane koristeći termostabilne DNK polimeraze. Ponavljanje ciklusa od denaturacija dvostruke spirale DNK nakon završetka žarenja sa prajmera dovesti do eksponencijalni rast broja DNK fragmenata okružen sekvence nukleotida koji odgovara na primarnu strukturu prajmera. Kao rezultat toga, u iznosu od 30-40 ciklusa pojačanja reakcije molekula DNK u uzorku je povećan u 108-108 puta, što omogućava da se utvrdi TsPDvo 104 / ml, a ne daje cross-reakcije sa drugim virusima (Kweon S. N. et al., 1997). U isto vrijeme, niko od RV prajmera nije reagovao na RT-PCR fekalnim uzorcima koji sadrže Rotavirusi druge grupe, kao i uzorci iz kontrole nezaraženih ljudi i životinja, što ukazuje na visoku specifičnost metode (Eiden J. et al., 1991).

Pojačanje sekvence može se vidjeti u UV svjetlu proizvoda PCR nakon frakcioniranje gel elektroforeze u prisustvu Ethidium bromid (Gouvea V. et al., 1991 Oishi I. et al., 1993). Dobiveni količina DNK fragmenata je dovoljan za analizu od strane drugih molekularno-biološke metode: Dot-blot hibridizacija, sekvenciranje, kloniranje i drugi.

Trenutno sprovode izbor prajmera za detekciju rotavirusa grupe A, B i C gena, 9, 8 i 6, odnosno (Gouvea V. et al., 1991 Oishi I. et al., 1993 Buesa I. et al., 1996 ). Metodom RT-PCR je korištena kako bi se utvrdilo Rotavirusi čak iu slučajevima kada druge metode ne dozvoljavaju da ih identifikuje (Ushijima N. et al., 1992- Oishi I. et al., 1993 Jiang B. et al., 1995). U posljednjih nekoliko godina, predstavljamo podaci o upotrebi PCR za G i R serotip RV. Autori su pokazali da je najčešće nalaze u ljudi Rotavirusi pripadaju vrstama G1-G4 i P4, P6, P8 i P10 (Tanigučija K. et al., 1992- Correll RJ, Palombo EA, 1996- Husain M. et al., 1996- Espinoza F. et al., 1997). Ovi podaci nam omogućavaju da brzo dobiti detaljne informacije o molekularne osnove epidemioloških varijacija rotavirusa, što je izuzetno važno u epidemiologije i na izgradnji rotavirus vakcina (Richardson S. et al., 1998 Leite I. et al., 1996 Arista S. et al., 1997- Adah M. et al., 1997).

Pored velikog broja studija potvrđuje nadređenog specifičnost i osjetljivost PCR, a broj autora sproveo uporednom testu ove metode s tradicionalnim dijagnostičke metode: ELISA, EF PAGE, TEM. PCR veća osjetljivost u odnosu na ELISA pokazala Wilde J. 103 uzorak stolice je dobijen 40 pregleda djece. PCR otkrivena 60 pozitivnih slučajeva (53%) u odnosu na 37 (36%) u IFA. Nadalje, prosječno trajanje virusnih izlučivanje bila jednaka 9,5 dana za podatke PCR, u usporedbi sa 5,6 dana u IFA (Wilde J. et al., 1991). Slične rezultate, pokazujući veliku osjetljivost PCR u odnosu na ELISA, dobila identifikacija Tani-guchi K. 115 kopromaterialov iz bolesnu djecu izumitelja da je dijagnoza se potvrđuje PCR u 93% u odnosu na 82,6 ELISA. (Taniguchi K. et al., 1992).

Novije rad je u potpunosti potvrdio ove rezultate. Na taj način, poređenjem PCR PAGE i ELISA se koristi za detekciju Rotavirusi u materijalima bolesnu djecu, postotak pozitivnih nalaza je: 94, 91 i 80%, respektivno (Husain M. et al, 1995.). Slični rezultati su dobijeni tokom ispitivanja od 220 pacijenata IKP. Postotak otkrivanja rotavirusa u materijalu pojedinaca anketirao PCR, ELISA, SDS-a i TEM, odnosno za 30, 29, 26,8 i 25,4 (Buesa J. et al., 1996). . Prema Masendyacz R. et al, osjetljivost i specifičnost, metode otkrivanja tri RV kopromaterialyah dijareje pacijenata bili su: PCR - 92 i 98% - RNA-DNA hibridizacije - 80 i 99% - IFA - 73 i 81% (Masendyacz R. et al., 1998).

Kao što je prikazano od strane prijavljenih podataka, analiza rotavirusa RNK se sve više provodi u praksi, uprkos određenom složenosti i visoke troškove istraživanja, a koristi se i za dijagnostiku i za karakterizaciju patogena. Ovaj proces je intenzivirana sa razvojem PCR, najosjetljivijih i specifičnih dijagnostičkih tehniku ​​koja, po mišljenju mnogih autora, trenutno je "zlatni standard", što je ranije bio TEM (Nakagomi O. et al., 1994 Masendyacz R. et al ., 1998).

Dakle, PCR je molekularne biologije test nove generacije, što otvara velike mogućnosti u klasifikaciji, kucanje, opće i molekularnu epidemiologiju rotavirusa. Međutim, treba napomenuti da je PCR zahtijeva visoko stručnih istraživača, skupi reagensi i relativno komplikovan opreme. U isto vrijeme, dalje usavršavanje metoda, očigledno je da se PCR više dostupnim širok spektar dijagnostičkih laboratorija.

Sumirajući korištenje metoda identifikacije rotavirusa u različitim istraživanjima objektima, uočeno je da su gotovo sav materijal govori u ovom metoda ima svojih prednosti i mana, izražena u različitim stupnjevima. Primanje brzinu odziva, mogućnost ankete velikog broja uzoraka istovremeno, način složenosti i potrebu da koriste skupe opreme i reagentiki, osjetljivost i specifičnost metode i, na kraju, troškove analize svake od ovih metoda uvelike razlikuju. Stoga - izbor odgovarajuće metode u svakom slučaju je individualan i nije lak zadatak s obzirom na veliki broj testova, različite mogućnosti dijagnostičkih laboratorija i izazove koji stoje pred njima.