Rv III generacija vakcina. Crijevnih bolesti.

Također smo napravili pokušaj da se identifikuje "prazne" viriona iz koprobiomassy RV. Metoda velike brzine centrifugiranje u diskontinuirano gradijent gustoće cezij klorida ili sulfata (1,0-1,5 g / cm2) bili u mogućnosti da podijele čestice RV smo "puno" i "prazne", što je potvrdio i elektron mikroskopske kontrolom.

Tako je utvrđeno mogućnost odvajanja RV garantuje njihovu živu biomasu gustoća koja se može koristiti kao sredstvo ili korak pročišćavanja, koncentracije i akumulacija virusnog materijala u dizajnu dijagnostičkih i preventivnih lijekova (Vasile u B. J. et al., 1991) .

Razvoj genetičkog inženjerstva pristupa u stvaranju RV vakcina se ogleda u pokušajima da simulira tzv subjediničnom vakcinom.

Koristeći HPV kao kandidat vakcine koje izazivaju zaštitni učinak u kalemljenje, bilo je potrebno određeno evolucijski put. Metoda za proizvodnju formulacije vakcine zasnovan na VP6 bio predmet prijave za izum (Sahara M. et al., Sjedinjenih Američkih Država za patente, 1990).

Autori izgrađena preparati koji sadrži epi-topnye molekula vezana za protein nosač monomera ili oligomera polipeptida homologna VP6, koja se formirala HPV-a. VP6 gen je izolovan rekombinantne plazmida, a zatim kompleksni sa različitim polipeptida RV.

Ranije je pokazano da se unutrašnja kapside VP6 protein ima sposobnost da samostalno sastaviti. Na osnovu ovog fenomena je trenutno realizuje mogućnost dobijanja virusa kao čestice (HPV) za imunizaciju životinja. RV gena koji kodiraju strukturne proteine, kloniran je u bakulovirus i rekombinantne RV ko-express proteina u bakulovirus sistem (Estes MK i dr., 1996- Crawford S. E. et al., 1994 Labbe M. et al., 1991). Izraženih proteina samosobira-RV se formiraju i HPV-a. Co-izražavanja različitih kombinacija strukturnih proteina HPV dovodi do stvaranja različitih sastava proteina.

Nedavni podaci su pokazali da parenteralne administracije inaktivisane RV laboratorijskih životinja dovodi do njihovog potpunu zaštitu protiv homologna oralne infekcije, zbog čega je bilo moguće procijeniti šanse alternativnih načina vakcinacije HPV-om.

Koristeći kloniranje i izražavanja u bakulovirus sistem strukturnih proteina VP4, VP6 i VP7 RV RNC (soj C 486) Redmond M. et al. (1993) su dobijeni HPV-om, koji se sastoji na osnovu VP6 ili VP4, ili VP7. Miševi u eksperimentima dizajniran HPV izazvao humoralni antitijela otkrije IEM. Međutim, samo HPV VP4 izazvala antitela koja neutrališu virus i hemaglutinacija inhibira. Infekcija miševa vakcinisano uz prisustvo HPV VP4, pronašao zaštitni učinak protiv homologni (C 486) i heterologne (SA-11) RV. Nasuprot tome, potomaka miševa tretirana samo uz prisustvo HPV VP6, pokazalo djelomično zaštićeni.

Nakon toga imunogeni aktivnost i zaštitna efikasnost parenteralne administracije HPV različitog sastava (VP6 / 7, VP2 / 6/7, VP2 / 4/6/7) i adjuvansi A1 OH, QS21 je studirao Conner ME et al. (1996).

Autori izgrađena drugačijem sastavu HPV tokom koinfekciju SF9 ćelija (0,2 ili 5 PFU po ćeliji) sa raznim kombinacijama bakulovirus rekombinanata (Crawford S. E. et al., 1994). Bakulovirus rekombinacija, korišteni su u modeliranju HPV kodirani VP2 (RF) ili VP6 (486 C) KRS- VP6, P [2] VP4 ili G3VP7 majmun ili Gl VP7 (8697) HRV. HPV je pročišćen gustina gradijent cezij klorid ili 40% saharoze.

U procesu testiranja različitih kompozicija HPV rekombinacija, strukturnih proteina dvostruko ubrizgava miševi (0,2-20 ug) i kunića (10-20 mg), zatim infekcija RV SA-11 i ALA. Utvrđeno je da zečevi vakcinisana VP2 / 4/6/7 ili VP2 / 6/7 inducirana visok nivo RV serumu i coproantibody IgG klase, ali ne i IgA, i indukcija fekalnih IgG povezani s potpuno ili djelimično zaštitu od oralnog RV ALA infekcije. I to se ne uticaja bilo koje adjuvantne intenzitetu imunog odgovora. U miševa, slični rezultati dobijeni su osim što je adjuvans s QS21 HPV izazvane reakcije antitijela (ELISA podataka i PH), porediti sa postići imunizacije RV SA-11. Intenzitet imunoloških promjena zavisi od doze HPV-a. Treba napomenuti da su miševi vakcinisana sa VP2 / 6/7 ili VP2 / 4/6/7 također je otkriveno i heterotypic serumu i coproantibody. Ova činjenica je posebno važno u tome što pokazuje mogućnost smanjenja broja G-vrsta ušli u podjedinice vakcine, a to, pak, ukazuje na mogućnost HPV dizajna sa ograničenim brojem proteina, čime se smanjuje njihov trošak. Što se tiče HPV VP6 / 7, i oni su bili imunogeni u miševa, ali je njihova relativna nestabilnost nije pomogla njihova obzir kao potencijalni kandidati za vakcine. Kao rezultat ispitivanja, autori su zaključili da HPV može pružiti siguran i efikasan alternativa ili dodatak uživo RV vakcina za ljude i za životinje (Conner M. T. et al., 1996, 1997).

Evaluacija efikasnosti različitih HPV ruta administracije, kao i njihov sastav i posvećen novim immunoadjuvant rad O'Neal S. et al. (1997). Autori su proučavali imunogenost i zaštitna efikasnost oralne i nazalne administracija RV subjediničnom vakcinom sastoji VP2 / 6 i G3 2/6/7 pomiješana s kolera toksina. Utvrđeno je da oralne primjene kod odraslih miševa naznačeno HPV izazvanih pojava u serumu i IgA i IgG coproantibody klase. Osim toga, visoke doze (100 mg) je pomogao da se zaštiti HPV naknadnih RV infekcija (> smanjenje 50% virusnih prolijevanja) u 50% miševa.

Intranazalne način administracija HPV stimulirana intenzivnije nego oralno, i lokalnu proizvodnju seruma antitijela. Miševi koji su dobili HPV intranazalno, bili zaštićeni od naknadne infekcije, izolacija virusa nakon infekcije bio odsutan. Nije bilo razlike u imunogenost i zaštitni učinak između 2/6 i 2/6/7 HPV-a. Treba naglasiti da je zaštita je postignuta bez zaštitnog VP7 i VP4 antigene.

Zanimljivi rezultati su dobijeni kada je proučavao učinak immunoadjuvant - kolere toksin u imunogenost i zaštitna efikasnost HPV-a. Intranazalne administracija VP2 / 6 bez kolera toksin izazvalo formiranje serumu i crijevnih antitijela u niži titar u odnosu na imunološke smjene u njegovoj primjeni.

Korištenje visokih doza (100 mikrograma) VP2 / 6 bez adjuvantne stimulirana samo djelimično smanjenje virusnog prolijevanja u prosjeku 38% zaraženih miševa.

U isto vrijeme pod sličnim uvjetima imunizacije i naknadne infekcije miševa zaštite na visokom nivou, kada je pod upravom adjuvantne postići sa doza Imunogen je deset puta manji (10 str) nego koristiti prije. Dakle, intranazalne administracija HPV imunološki adjuvantne, prema autorima, može poslužiti kao prototip za sigurno ne razmnožavaju RV vakcine ne samo za životinje, već i za ljude.

Uz kolera toksin (CT), pod eksperimentalnim uslovima autori su i testirani i toksina temperature osjetljiva E. Coli: LT LT R129G.

Utvrđeno je da 2/6 HPV koristeći sve ove immunoadjuvants izazvane značajnu zaštitu od miševa protiv kasnijih RV infekcija. Međutim, miševi koji su dobili 2/6 HPV u kombinaciji sa adjuvans LT, proizveo znatno veći titar crijevnih IgA antitijela u odnosu na CT. Sve miševa koji su dobili HPV 2/6 sa LT i LT R192G su potpuno (100%) zaštićen od RV infekcija, dok je CT - 91%. Immunoadjuvant LT LT 192 g pokazala bezopasan i efikasan imunostimulansi koji su omogućili autore da ih preporučiti za korištenje s HPV (O'Neal S. et al., 1998).

Kao novi pravac sprečavanje RV infekcija je nedavno predložila DNA vakcina kodiraju strukturne proteine ​​RV (VP4, VP6, VP7) i imaju određene čuvar potencijal. U razvoju cjepiva poslednje generacije, osim immunoadjuvants u kombinaciji sastav se daje kao ubili bakterije ili njihove antigene, kao što su Salmonella malopatogennye i tsitomegalovi-rus, polio, adenovirus, pox virus.

Treba napomenuti da je perspektiva razvoja i korištenja klonirane Enterobacteriaceae (posebno E. coli) koji sadrže fragmente genoma DNK kodiranje ljudskih RV za sintezu virus-specifičnih antigena raspravlja u kasnim 80-ih godina (WHO Drug inf., 1989). Kao vektor sistem koji se koristi RV vaccinia virus (Poncet D. et al., 1990). Kao rezultat toga, razvoj genetskog inženjeringa je dizajniran s rekombinantne vaccinia virus ubačen u timidin kinaze gen cDNA VP6 SA-11. Infekcija s ovom rekombinantne MA 104 ćelija rezultiralo izraz VP6, koja je izazvana imunizacije formiranja miševa antitijela, ne, međutim, virus neutralizaciju aktivnost.

Imuni odgovor na izražene rekombinantni vaccinia virus stranih antigena može biti znatno poboljšana "sidrenja" potonjeg na oklopu Zaraženost ćelija. Pojačanje imunogenost VP6 i VP7 se mogu javiti direktno preko B-ćelija i uskoro T-helper (Andrew M. et al., 1991).

Zbog, Herrmann činjenicu da, kao što je prikazano ranije zapažanja, parenteralne uprava pruža RV vakcine na miševima i zečevima zaštitu od infekcije (Conner M. T. et al., 1993 McNeal M. et al., 1995) IE i dr. (1996.) sprovela je studiju na osnovu mogućnost korištenja DNA vakcina za prevenciju RV infekcija. Rotavirus DNA vakcine su pripremili uključuje komplementarne DNA kodiranje Murine VP4, VP6 ili VP7, u vektor izraza (Yasutomi Y. et al., 1996). RV DNA vakcina daje intradermalno pomoću tzv gen pištolja (gen-gun).

Način «gen-gun» sastoji se u tome što se DNA vakcina se apsorbuje na zlato perle (0,95 nm), koji se uvode u epidermis od helijuma puls (Accell gen-gun- Agracetus, Middleton, WI). Ova metoda je najefikasniji način dostave potrebnu količinu DNA vakcina epidermisa (Fynan E. F. et al., 1993).

ocijenjeni su plazmida DNA vakcine (VP4, VP6 i VP7) u eksperimentima odraslih miševa (BALB / c) njihovu sposobnost da izazovu imunološku reakciju i zaštitu od infekcije RV Edim. Utvrđeno je da tretman miševa udvostručenja 0,4 ug DNA vakcine praćeno povećanom titar IgG antitijela (ELISA podataka) u prosjeku 1: 300 koristeći VP4 i VP7 i 1: 3200 - imunizacija sa VP6.

U isto vrijeme koje odredi VNA kod miševa tretiranih sa živim virusom (Edim), DNK vakcine VP4 i VP7, ali ne i kod životinja vakcinisano sa DNK vakcine VP6. Uz povećanje humoralne titar antitijela povećana, a sadržaj IgA klase antitijela, što je najviša stopa je kod miševa vakcinisana sa DNK VP6. CTL aktivnost je izmjerena za određivanje staničnog imuniteta. Kada je odnos efektora ciljati 60: 1 posto specifične lize zaraženih miševa RV Edim, bila je jednaka 57 ± 27%, a na VP4 vakcinacije - 32 ± 14% - VP6 - 33 + 31% - VP7 - 42 ± 17% - plazmida kontrola DNK - 2 ± 2%.

Dakle, dva puta administraciju plazmida DNA vakcine VP4, VP6 i VP7 pokazao zaštitu slične onoj kod miševa tretiranih oralno sa živim RV Edim na 100 ID50- Herrmann J. et al. Pokazalo se da mehanizam zaštite uključene ćelijski imunitet, IgA posredovano intracelularni neispravan virus neutralizaciju ili oba ova faktora. Autori smatraju da rezultati pokazuju efikasnost plazmida VP4, VP6 i VP7 DNA vakcine stimulativno i specifična antitijela i CTL (Herrmann J. et al., 1996.-Chen S. C. et al., 1997). U isto vrijeme, Choi A. et al. (1997) prijavio je da DNK VP6, koji izazivaju visok nivo u serumu uglavnom IgG, nije u stanju da pruži zaštitu od naknadnih infekcija.

U posljednjih nekoliko godina posvećena vakcina-ke-RV infekcija su termini "sluznice vakcina" i "sluzokože imunitet". Nadražaj vakcine su nadražaj (oralno, intranazalno, enteralnu, ali dr.), A uključuju specifične antigene i adjuvansi zatvoren u mikrokapsula, koja ih štiti od efekata probavnih enzima i otpornost na niske vrijednosti pH.

metoda RV mikroinkapsulacije se temelji na sposobnosti ionnosvyazannyh rastvorljivi u vodi anionskih polimera i amina povećati proizvodnju imuniteta virus-specifične, kao što je prikazano Knoury S. A. et al. (1995), Brown K. A. et al. (1995). Miševi vakcinisana usmeno inaktivira oklopljenog neinkapsuli i RV-Rowan majmuna pri dozama od 1,75 mg ili 0,35, utvrđeno je prisustvo specifičnih antitijela u serumu i crevnog sadržaja u kulturama organa crijevne-povezane limfnog (GALT). Utvrđeno je da su virus-specifičnih IgA proizvodi limfocita tankim lamina propria creva životinja vakcinisano, sa dvije doze mikro-roinkapsulirovannogo majmunski RV. Miševi vakcinisana sa neučahureni RV, bili imunotoleranciju. Dakle, autori su pokazali da mikrokapsulirova-set može biti efikasna u indukciji GALT odgovor virusa specifične Nakon oralne primjene malih količina virusnih antigena. Osim toga, autori pokazali mogućnost Mikroinkapsulirani vakcine sa određenom periodu biorazgradnje imaju učinak booster. Treba naglasiti da je novi način za isporuku vakcina za zaštitu antigen od efekata crijevnih enzima i raznih uplitanja supstance, dostavljanja direktno na Peyer je flastera (M. Estes, 1996).

Tako je, sumirajući fazama razvoja vaktsinopro-profilaksu, treba napomenuti da je najveći napredak u zaštiti protiv RV infekcija povezanih sa razvojem i raznolikost testova žive polivalentan reassortant vakcina dizajniran na osnovu ukupne neto Jenny Rovsky pristup i genetski inženjering. Tokom opsežne kliničke i epidemiološke istraživanja sprovedena u različitim regijama svijeta na kontingenata odraslih i djece svih uzrasta, oni su pokazali svoje neškodljivosti, niske reaktivnosti, visoki imunogeni aktivnost i učinkovitost u prevenciji RV infekcija, kao iu smanjenju incidencije teških kliničkih oblika bolesti i hospitalizacije .

Najperspektivnije od polivalentne reassortant vakcine RRV-TV i WC3, koji je trenutno u fazi završno testiranje prije licenciranja.

Uz gore vakcina II generacija u posljednjih nekoliko godina dizajnirana ne replicira podjedinice vakcina i vektor DNK nalazi na pretkliničkim korak validacije.

Pozitivni rezultati dobiveni u eksperimentalnim uslovima na životinjama, ukazuju na to da njihova studija se može proširiti na ljude.