Virološki studija. Crijevnih bolesti. (Part 1)

Izolacija virusa. Detekcija virusne agent - exciter patološko stanje je glavni trijada Koch dokaz infekcije uzročnosti. U tom smislu, izolacija virusa je izuzetno važno i je osnovna karika u lancu događaja za laboratorijske dijagnostike rotavirusa infekcije. Osim prolivanje ostaje jedan od rijetkih prakse koje mogu biti praćen otkrivanju novih virusnih agenasa, sredstva za nepoznatog sada virusnih bolesti. Stoga, izolacija virusa u raznim biološkim modelima (u većini slučajeva - kultura ćelija) su vrlo široko praktikuje. Trenutno, kao biološki model se najčešće koristi brojne ćelijske kulture: MA104, 4647, GBK, HT-29, CV1, Vero, Caco-2, itd (Ramishvili L. G. et al, 1991 J. Hapchaev .. X. et al., 1989 Clark N. et al., 1988- Kono T. et al., 1993 Ward R. et al., 1990 Bernstein D. et al., 1989 Sato K. et al. , 1995- Weber B. et al., 1992- Markovska-Daniel J. et al., 1996- Shinozaki K. et al., 1996- Superti F. et al., 1997).

Izolacija virusa u ćeliji kulturama odvija u 2 faze: virusne infekcije ćelijske kulture (I) i njegovu reprodukciju na dokumentovanju izgledu CPE ili ELISA, IPM, STRANICA, PCR metoda plyakoobrazovaniya TEM i (II). Zbog posebnog značaja ove metode možemo sebi dozvoliti nekim detaljima. Uzorci stolice uzeti u prvih 2-3 dana bolesti u sterilnom laboratorijsko staklo i prevezli u posudu sa ledom ili drugim rashladnog sredstva. Ispitnog materijala treba tretirati odmah nakon isporuke u laboratoriju ili skladišti na temperaturama ispod nule. Pre nego što počnete virološki uzorci su odmrznuti, uzeti 0,5-1 g fecesa i srednjih rast je dodan (Eagle, Earl, Henke) u iznosu potrebno dobiti 10% kaše. Gnojnica gomogeneziruyut ponavljati sve dok uniformi energičnu trese (sa ili bez perle), ili zamrzavanje i odmrzavanje. Homogenizacija cisterne je nježan trese, t. K. Virusosoderzhaschego smrzavanja i otapanja materijala dovodi do degradacije VP7 (Nirdnoy W. et al., 1995). Suspenzija se centrifugira za 10-15 minuta na 1000-2000 g, oslobođen iz sedimenta i supernatant se sipa, ali 1 ml za virološki studije ili pohranjene na -20-70 C, u zavisnosti od perioda skladištenja. Nakon toga, virus je aktivan 30 minuta na 37 ° C sa tripsina u koncentraciji od 10 ug / ml i centrifugira 2 minute na 15.000 g. Zatim, četiri dana monolayer oprati dva puta sa DMEM i zaraziti 1-2 lg (10-30 čestica virusa po ćeliji) na aktiviran RV medij (DMEM, Eagle MEM s Hanks) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma i antibiotika. Prema različitim autorima, koristimo 100-500 jedinica. penicilin, 100-500 mg streptomicina, 40 mg gentamicin i 50 jedinica. nistatin u 1 ml. Nakon 2 sata adsorpcije na 37 ° C, ćelije su isprane i natovareni DMEM koji sadrži antibiotike i 4-13 ug / ml tripsina (Clark N. et al., 1988- Sato K. et al., 1995).

Pozitivan efekat na tripsina pokazala rotavirus replikacije procesa i T. Kono et al. (1993). Autori su potvrdili da je tripsina aktivira proizvodnju virus selektivno utječu na funkciju VP4 i vanjskog kapside proteina raspada njih. To vodi, s jedne strane, kako bi se smanjila GEMAG-glyutiniruyuschey aktivnost virusa, a sa druge - kako bi se poboljšala prodor virusa u ćeliju, koja je na tretirana tripsina viriona ući u ćeliju i repliciraju, a sirovo - .. podvrgnut endocitoze, a ne replicirati. Dakle, primjena tripsina u dozi od 0,1-10 mg / ml dovodi do povećane infektivnost virusa. Zaražene kulture stanica zabilježene su za 5-7 dana. Pojava CPE ukazuje na prisustvo virusa, koji se potom dokumentirana TEM EF stranicu pomoću antiseruma ili - IEM, i IFM al.

Ako se ne CPE bili zamrznuti kulture i napraviti dodatne odlomke u istim uslovima, osim da se virus aktivira tretman tripsina 4 ug / ml na sobnoj temperaturi 2 sata.

Od prolaz 4, CPE obično otkriven nakon 4-5 dana nakon infekcije (Ward R. et al., 1990 Bernstein D. et al., 1989).

Međutim, s obzirom na nisku osjetljivost na kulture stanica prirodnih izolira rutinska dijagnostička metoda rotavirus gastroenteritis tokom rasterećenja nije. Jer neprilagođena da izoluju ćelije mogu reproducirati u njima, bez otkrivanja CPE virusa dodatnim metodološkim tehnike značajno povećava efikasnost metode. To potvrđuje i studija koju je proveo W. Weber et al. (1992). Autori, uz otkrivanje rotavirusa CPD sproveo komparativna studija nekoliko metoda za detekciju rotavirusa u inficiranih ćelija ispitivanjem uzoraka 121 stolice djeci sa gastroenteritisa prije dobi od 3 godine. Standard za izbor u MA-104 ćelija pod kontrolom HNS-a pokazala je samo 3,3% pozitivnih nalaza, dok je upotreba tagova immunoperoxidase dijagnostička razina podiže na 40,5%, a upotreba IFA i EF PAGE - do 54,4% i 46,3 %, respektivno.

Jer HRV ne uvijek izazvati CPE i replicirati u konvencionalnim kulturama ćelija, Genthe V. et al. (199TS nakon 18 sati kulture u MA-104 je otkrio virusni intracelularne antigen ELISA korištenjem antiseruma, peroksidaze označen. Poređenje tsitoimmunnoy umjetnost označen antitela sa komercijalnim za postavljanje test sisteme, ELISA i lateks aglutinacije su pokazali da tsitoimmunny metoda 10 puta osjetljiviji.

Slični rezultati su dobiveni u posljednjih nekoliko godina. Pa prema Markowska-Daniel J. et al., ELISA rotavirusa u fekalijama je pronađen u 32% slučajeva. Primjena MA-104 kulture i reprodukcije dokument IPM virus, TEM i EF STRANA ćelija povećao postotak detekcije virusa na 64,0% (Markowska-Daniel J. et al., 1996).

Klasični supstrat za reprodukciju Rotavirusi je linija bubrega ćelija MA-104 majmuna koji se koristi najčešće, ne samo za dijagnozu, ali i za potrebe istraživanja (Johansen K. et al., 1997- Kobayashi N. et al., 1995) i iu veterinarskoj praksi (Gulati V. et al., 1997). Pokazano je da je MA-104 podržava ne samo reprodukciju rotavirus grupe A i C, ali se pruža na visokoj koncentraciji u kulturi srednji sadržaj tripsina (Tsunemitsu N. et al., 1991). Međutim, zbog nedovoljne osjetljivosti ćelija na rotavirusa se održava u potragu za drugim linijama, ćelije i metode pogodne za izolaciju i reprodukciju rotavirusa, i razvoj metoda za povećanje osjetljivosti ćelija na rotavirusa. Utvrđeno je da linija ćelije ljudskog karcinoma debelog creva HT-29 bio je osjetljiviji od MA-104 u raspodjeli ljudskih rotavirusa. Nasuprot tome, MA-104 HT-29 rotavirus rast otkrivene u prvom ili kasnijim prolazi, čak i ako je postotak zaraženih ćelija bila je niska (Superti F et al., 1991, 1997).

Druga linija od karcinoma debelog creva Caco-2 stanica je također se koristi za isticanje RV. Koristeći ovu stanična linija u prisutnosti tripsina (4 .mu.g / ml) je izoliran Grupa C RV u Japanu, koji je reproducirati bez HNS-a je dokumentovano TEM IEM, i IFM povratne TPHA (Shinozaki K. et al., 1996).

Ćelije bubrega linija goveda, GBK je dao i više rezultate u titracije Rotavirusi izoliran od teladi (1-2 lg na višim od MA-104 ćelija). Treba napomenuti, međutim, da ćelije prethodno tretirane dietilaminoetildekstranom dozom 50 je dodao ug / ml i srednje održavanje kontsentartsii tripsina 5 g / ml (Kono T. et al., 1993).

Povećanje osjetljivosti ćelija virusima općenito, a posebno Rotavirusi ostvaruje pomoću za tu svrhu kemijske i fizičke metode. Pokazano je da je centrifugiranje, stalno ljuljanje ili iznenadne termalni efekt (toplotni udar) promovirati rast broja oštećenih ćelija, povećanje prinosa virusa ili povećati nivo virusnih prolijevanja u dijagnostici istraživanja virusologije. Kemijski metode utjecaja treba istaći efikasnost dimethylsulfoxide, što pojačava proces transformacije ćelija zaražen virusom, plyak povećava broj i veličina povećava prinos virus (Hyghes J. N., 1993). Tanja identifikaciju virusa može se postići pomoću plakova formiran pod svoj uticaj u kulturi tkiva. Način stvaranja plakova razvijenih Dulbecco R. (1952), u različitim verzijama i široko se koristi u ovom trenutku. Princip metode je da razrjeđivanje virusa suspenzija se primjenjuje na kulturama monolayer tkiva u Petri ploskostennyh bočice, bunari ploča. Nakon što virus adsorpcija na ćelije prekriven slojem nutrijenata agar. Zbog Agar poklopac, reprodukciju i širenje virusa je ograničena na samo početku zaražen i susjednim ćelijama. Nastali organski ćelija degeneracija žarišta - takozvani "plakovi" (plyaki). Obično su identifikovani bojenjem s sloj boje intravital ćelije - neutralno crveno, što je bilo uključeno u sastav agar premaza, ili nanosi na to neposredno prije na osnovu rezultata. Plakete ne adsorbovati boju i zbog toga biti u obliku svijetlih točaka na pozadini obojena živih ćelija (Tosser J. et al., 1994).

Za otkrivanje plakete osim neutralne crvene boje mogu se koristiti i druge boje, kao što su kristal violet. Jedan od zaraznih virus čestica predstavlja jedan plak, koji omogućava da se prijave blyash-koobrazovanie kao tačan metoda za kvantitativno istraživanje virusa infektivnost i mjerenje neutralizaciju aktivnost antitijela. Koristeći plaka može očistiti virus, tj. E. dobiti svoj čiste linije (Isa R., Snodgrass D. 1994- Ward R. et al., 1998). U obavljanju takvih sloj čišćenje ćelija nakon adsorpcije virusa potrebno je temeljito oprati čestice virusa iz adsorbovane pa tek onda primijeniti agar premaz. Treba napomenuti da je upotreba sulfoksid, dietilaminoetildenetrana (DEAE), tripsina djeluje stimulativno na formiranje plaka (i spuštanje agar koncentracije u premaz).

Shgapo N. et al. (1987) koji se koristi kao način da se plakete za detekciju Raman rotavirusa u novorođene teladi u odnosu dva skladu staničnih kultura MA-104 i GBK (RNC ćelije bubrega). Potvrđujući korištenje MA-104 ćelija, oni su predložili da koriste za ovu svrhu liniju GBK ćelije i razvili modifikaciju plaka. Plastične Petrijevu posudu promjera 6 cm sijao 0.8-1.0 x 106 ćelija u 5 ml srednje rasta. Nakon 2-3 dana nakon formiranja monoslojnih ćelije su oprati i dodati u 2 ml 0 rotavirusa (soj Lincoln) razrijeđen u kulturi srednje sa 50 ug / ml DEAE. Nakon 90 minuta inkubacije na 37 ° C je slojevita 5 ml kulture srednje sa 0,8% agar, 10% Tryptose fosfat čorba, 5 g / ml tripsina i 50 ug / ml DEAE. Nakon 3 dana, drugi slojevita premaz koji sadrže neutralne crvene na konačnu razvodnjavanje 1: 5000. Nakon 6-8 sati je izbrojano chisyo plakete.

Još jedna modifikacija dobiti plakete koristiti Bernstein D. et al. (1989) u proučavanju razdvajanje vakcine kod odraslih dobrovoljaca vakcinisana sa vakcinom rotavirus WC 3. U tu svrhu, 1 ml obrađena kao što je opisano gore, uzorci stolice su inkubirani u trajanju od 30 minuta na 37 ° C s 10 ug tripsina i stavlja na monolayer mA- 104, oprana dva puta uravnoteženog rastvor soli Erl. Nakon 1 chasa monolayer adsorpcije na 37C i oprati ponovo sipa DMEM medij sa antibioticima, 4 mikrograma / ml tripsina, 25 ug / ml DEAE i 0,2% agaroznom i inkubirani za 4 dana na temperaturi od 37 C. Drugi premaz slojem agara Nakon uklanjanja medij s kristal violet za vizualizaciju plyak.

Trenutno, vizualizacija plyak postiže imunofluorescencije bojenja ili radioaktivnih oznaka, kao metoda koja povećava specifičnost i osjetljivost (Isa R. et al., 1994).

Dakle, prolivanja ostaje važan način za potvrdu etiologije bolesti, ali sada zbog mogućnosti koristeći širok spektar modernih dijagnostičkih metoda njegove primjene kao rutinski dijagnostički test čini nepraktično.

Elektronska mikroskopija RV. Otkrivanje virusa elektronskim mikroskopom se vrši u dva modifikacijama: direktna elektronska mikroskopija (TEM) i immunnoelektronnaya mikroskopija (IEM).

Poznato je da u prvim danima sadržaja bolesti rotavirus kopromaterialah dostiže takvi iznosi koji omogućavaju njeno otkrivanje od strane elektronskim mikroskopom u D-20% rastvoru bez daljnje koncentracije. Nakon suspenzije je pojasnio centrifugiranje nekoliko kapi supernatant rješenja kontrast phosphotungstic kiseline (2,1%) uranil acetat (0,25-1%) ili amonijum molybdate (1%) i primijeniti na elektronskim mikroskopom sita temu. studija droga sprovedena u elektronskim mikroskopom na uvećanje 50 otkrio 000. Pripadnost rotavirus čestica određuje se karakteristične morfologije.

Metodom neposredne elektronske mikroskopije (TEM) u različitim modifikacijama se koristi za dijagnostičke i istraživačke svrhe, a široko (Vasil'yev B. J. et al., 1989, 1995, 1996 Zarubinsky B. J. et al., 1989- Khaustov VI 'i dr. 1989- Shelkovskaya N. G. et al., 1991 Dennehy R. et al., 1990 Donneli G. et al., 1993 Zeng C. et al., 1994 Oishi J. et al. , 1993- Gonzalez S. et al., 1995- Hendricks MK i dr., 1995- Jiang B. et al., 1995- Buesa J. et al., 1996- Tinari A. et al., 1996- Andrade GP et al., 1997- Superti F. et al., 1998).