Virološki studija. Crijevnih bolesti. (Part 2)

Primjena metode TEM otkrio visoku specifičnost, ali je njegova osjetljivost je inferiorna u odnosu na niz drugih laboratorijskih testova. Studija materijala 207 od dva bolesnika s ELISA dijagnostički kompleti i TEM kao referentna metoda je pokazala da TEM osjetljivost je 80% sa 100% specifičnost, dok je osjetljivost ELISA na osnovu monoklonskih antitijela bila veća (Dennehy R., 1990). Slični podaci dobijeni su prethodno Vasilevym B. J. et al. (1989). Usporedno omjer indeksa osjetljivosti i specifičnosti TEM i lateks aglutinacije reakcije (62,5% i 75%, respektivno) također su prikazani i Nozawa Santos N. S. (1989).

Nedavne studije su potvrdile ove nalaze. Ispitivanje od 103 djece metoda TEM EF stranicu i lateks aglutinacije reakcije (RLA) pokazala je da rotavirus je dokumentovano u 18% djece. Osim toga osjetljivost TEM tehnike EF stranicu i RLA je, odnosno 84%, 90% i 80%, specifičnost kao 100%, 100% i 81%, respektivno (Hendricks M. K. et al., 1995). Osim u dijagnostičke svrhe, TEM se koristi u istraživanje i razvoj. Dakle, Zeng S. et al. (1994) je korištena u rota-virusni VP2 proteina studija TEM.

Rezultati direktne elektronske mikroskopije sliku proširene funkcije i sklapanje strukturnih proteina VP2, kao i formiranje virusa kao čestice (HPV) i transport metabolita u virion.

Posebno velike korake su učinjeni u proučavanju morfologije rotavirusa modifikacijom TEM - krioe-elektroni mikroskopija koja omogućava proučavanje native neobojenu virion 35A s rezolucijom koja omogućava otkriti površinske strukture virusa i kanali prodire u virion (Yeager M. et al ,. 1990- 1994, Estes M., 1996- Prasad V. et al., 1996).

Dakle, direktna elektronska mikroskopija je efikasan dijagnostička metoda i optimalnu Refe-Laurence-test u razvoju novih dijagnostičkih metoda s obzirom na rezultat nesporna rezultate, što je rezultiralo u velikom broju istraživača smatra elektronske mikroskopije "zlatni standard» (Bryden A. S., 1990). TEM je jedinstvena u svojoj sposobnosti da otkrije sve osim Rotavirusi i druge crijevne patogene grupe: adeno-, kalitsi-, astro i korona virusa, kao i do sada nepoznate infektivnih agenasa (Espinoza F. et al, 1997.).

Immunoelectron mikroskopija (IEM) daje mogućnost ne samo za identifikaciju virusa u materijalu od pacijenta prema njegovim morfološkim likove, ali i da se potvrdi etiologije bolesti na određenom nivou. Princip rada je sljedeće: imuni serum rotavirusa u razvodnjavanje 1: 5 je pomiješana sa 0,4 ml 1% fekalnu suspenzija pojasnio centrifugiranjem. Smeša je inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi, 12 sati na 4 ° C, a zatim centrifugirani 90 minuta na 15 000 okr. / Min na pelet čestica virusa i imuni kompleksi. Nadosa-zling odlila i peleta resuspendovani u nekoliko kapi destilirane vode, obojena (kako je već spomenuto), i primijeniti na temu mreže. Mikroskopija izvršena je sa porastom droge 50.000.

U ovom slučaju rotavirusom čestice karakteristične morfologije i veličine su identifikovani u određenom imuni kompleks formacija koja intenzitet se ocjenjuje po broju klastera na mrežu i izražava se proizvoljnim skali od 0 do 4+.

Osjetljivost i specifičnost IEM može natjecati ne samo sa EMP, ali čak i sa takvim zajedničkim način kao što je ELISA. Prema tome, za kucanje od 24 sojeva rotavirusa ELISA i IEM na osnovu monoklonskih antitijela na VP7 je utvrđeno da IEM u 2-16 puta osjetljiviji od ELISA (Gerna G. et al., 1988).

Pored standardnih tehnika IEM u radovima nekoliko autora proučavao specifičnost i osjetljivost nekoliko modifikacija ove metode: filtriranje kompleks agar imunosorbentnim IEM i makromarkirovaniya kompleks proteina koloidno zlato. Pokazano je da su sve izmjene IEM barem 20-30 puta osjetljiviji od direktnih metoda. Najveći osjetljivost utjelovljenje razlikuje označen protein A - koloidno zlato, što je 1000 puta osjetljiviji nego direktan način IEM (Athanassions R. et al, 1994 Gonzalez S. A. et al, 1995.).. Očigledno je da je daljnje poboljšanje IEM će otvoriti nove mogućnosti za ovu metodu, ali njegova visoka osjetljivost se može postići pažljivim standardizacije reagensa, softvera s trol, kao i visoke kvalifikacije istraživača.

Obim IEM je opsežna: istraživanje i razvoj, kliničke prakse, laboratorijske dijagnostike, uključujući kucanje rotavirusa sojeva transkripta epidemija epidemija, itd (Gerna G. et al, 1988- Vasiljev BJ et al, 1989- Bates ... R. R. et al., 1993 Oishi J. et al., 1993 Zeng C. et al., 1994 Tokieda M. et al., 1996).

IEM (kao TEM) se također koristi kao referentna test za procjenu osjetljivosti i specifičnosti indeksi komercijalnih dijagnostičkih kitova (Ruggeri F. et al., 1992). Ilustrativni vrijednosti koristeći IEM metoda dekodiranja u epidemiološkim izbijanja može poslužiti podatak Oishi J. (1993). Stoga, kada je epidemija gastroenteritisa u studenata na koledžu u Japanu TEM morfoloških karakteristika u fecesu pacijenata nije pronađeno Rotavirusi. Osim toga, ovi materijali imaju negativan ELISA relativno rotavirus grupe A. Primjena IEM je pokazala da su ovi Rotavirusi su agenti grupe C, što je kasnije potvrdio i podaci PCR.

Sumirajući rezultate TEM i IEM, treba napomenuti da ove metode imaju najveće važnosti u početnim fazama dijagnozu rotavirus infekcije. Međutim, u budućnosti, uz razvoj metoda detekcije rotavirusa-antigena vrhunskog FEM IEM i osjetljivost, jednostavnost i brzina mogućnosti skrininga velikog broja niskih troškova materijala, TEM i IEM je dao časnu ulogu referentne metode.

U isto vrijeme, TEM i IEM i do tada se koristi u istraživanjima i kliničkoj praksi, oba metoda za detekciju novih infektivnih agenasa su nepoznati.

metoda imunofluorescencije (IPM) koji se koristi u dijagnostičke testove za otkrivanje antigena u staničnoj kulturi inficirani materijal od pacijenta, u biopsija i obdukciju materijala, au kopromaterialah dva modifikacijama.

Princip direktna metoda IPM svodi na objekt za obradu (inficirane ćelije ili dijelove tkiva) specifična antitijela označen s fluorescentnom bojom koja, u kontaktu sa antigena, pružaju fluorescentnim mikroskopom pod uticajem kratkog valne duljine vidljive valne duljine luminiscencije (zeleno ili crveno, ovisno o vrsti boje) . U indirektnoj metodi, objekt se podvrgnuti u dvije faze, ako se obrada prvi imuni serum do željene antigen, a zatim označeni Fluorohromno imunoglobulini izolirani od antispecies seruma.

Metodologija IPM je krajnje jednostavna: mrlje, inficiranih ćelija, pojasnio fekalne suspenzija su fiksirani na slajdovima sa acetonom na sobnoj temperaturi 10 minuta. Pripremi je zatim tretirana sa fluorescentnim rotavirus seruma dok kontrastne pozadine albumin-rodamin konjugata. Nakon inkubacije na 37 ° C u trajanju od 30 minuta, višak konjugata je isprana sa fosfatni pufer (pH 7,0), peru, suše i gledanje pod fluorescentnim mikroskopom. Treba napomenuti da uzimanje kopromaterialov u prvim satima nastanka povećava mogućnost otkrivanja rotavirusa antigena. Prilikom obavljanja IPM potrebno uključiti kontrole, koje se uglavnom koriste: liječenje određenog konjugata u nezaražene ćelije-ci, i - heterologne konjugovano ćelije zaražene rotavirusa. Najčešće se koristi u studijama IPM kulture tkiva zaražen materijala od ljudi ili životinja pacijenta, što vam omogućava da brzo otkriti virussoderzhaschie.kletki bez čekanja za HNS (ISRC ostrva La, 1988- Harsi C.et al., 1991 Tokieda M . i dr., 1996). 46 (17,1%) - tako 40 pozitivnih uzoraka (14,9%), na testu immunnofermentnom identifikovani su u anketi u IPM i EF u bolesnika s gastroenteritisa STRANA 268 djece mlađe od 1 godine. Podudarnost rezultata ove metode je kod 72% slučajeva (Harsi C. et al., 1991).

U posljednjih nekoliko godina, etiketa imunofluorescencije antitijela naširoko koristi za detekciju žarišta (plyak) rotavirusa u staničnoj kulturi, što uvelike poboljšava osjetljivost ove metode (Isa P.et al., 1994 Barnes G. et al., 1997). IPM se primjenjuje i za otkrivanje rotavirusa u vanjskom okruženju (Strappe R., 1990).

Dakle, trenutno imunofluorescencije metoda istraživanja u klasičnoj verziji je ograničenu upotrebu u dijagnostici rotavirusa gastroenteritisa.

Pretsipitatsionnye testovi se temelje na interakciji sa specifičnim virusnih antigena u serumu u agar pod utjecajem osmotskog procesa (RPG) ili kada se podvrgnuti statičkog električnog polja - kontra-imunoelektroforezom (VIEF) (Galko NV et al, 1986- Zalesskikh A. F. et al. ., 1990). Ove metode se koriste u ranim fazama studiranja rotavirus infekcije i sada je gotovo se ne odnosi u odnosu na razvoj boljih testova, sa izuzetkom fino istraživanja (Devitt S. et al., 1993). Međutim, pretsipitatsionnye Ispitivanja su poboljšana uvođenjem u čestice reakcija rotavirus označen 32P, čime će se povećati i osjetljivost i specifičnost testa (Tosser J. et al., 1994 Johansen K. et al u posljednjih nekoliko godina., 1994- Richardson S . et al., 1993 Colomina J. et al., 1998), kao i proteina Staphylococcus aureus (Colomina J. et al., 1998).

Linked imunološkom testu (ELISA) u dijagnostici rotavirusa gastroenteritisa se koristi najčešće. Broj publikacija o ovoj temi nekoliko stotina.

Princip ELISA metoda se svodi na činjenicu da je nosilac polimernog materijala (mikro ploče bunara, perle, šipke i tako dalje. D.) su obložene antitijela na rotavirus dodao ispitnog materijala iz pacijenta i inkubiraju na 36 ° C Rezultirajući kompleks AT-AG otkrivene ili antitijela označen sa enzimima ili serum se prvo tretira na željeni antigen, a zatim učiti iz dobrih Antiva-imunoglobulina označeni sa enzimom. Detekcija kompleksa AT-AT + AH enzim ili AT-AH-AT1-AT2 + obavlja dodavanjem enzima supstrat za pojavu u boji reakcije proizvod. Razmatranje rezultata reakcije vrši pomoću enzima imunoanaliza analizatora. Pored otkrivanje rotavirusa antigena ELISA može izvršiti serotyping izolira sebe u materijalu od pacijenata. Za tu svrhu, metoda blokiranje je predloženo određene epitope RV genoma pomoću monoklonskih tip antitijela ili podgrupe specifičnost (Green K. et al., 1990). Upotreba monoklonskih antitijela VP7 i VP4 različitih serotipova ljudskih Rotavirusi omogućuje ne samo za kucanje izolata, ali i promovira proučavanje epidemije procesa (Bishop R. et al., 1989 Gerna G. i dr 1989- UnicombL. Et al., 1993 Buesa G . i dr., 1996.-Gomez J. et al., 1990 Begue R. et al., 1992- Coulson BS, 1993- Woods P. et al., 1992- Nirdnoy W. et al., 1995- Wu H . et al., 1998 Masen-dyzac P. et al., 1998).

Prvi ELISA kompleti nastali su kao laboratorijske testove na kraju 70-tih godina, a zatim se komercijalni proizvodi su razvijeni. prvi komercijalni brojčanik je Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), koji je korišten u hemijskom sistemu. Onda Dako Ltd je stvorio više savršen set - Brzo Elisa Dako Ltd, a sada je broj komercijalnih testova koji se koriste u dijagnostičke praksi je izuzetno visoka: Ideia rotavirusom test, Dakopatts, testni sistem WHO, Testpack rotavirusom, rotavirusom EIA, Pathfinder, Kallestadt | Rotaclone, rotavirusom BIO - Bioenzabead Liton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost rotavirusom, rotavirusom Immunoassay, VIDAS rotavirusom, NIV (Gowez J. et al, 1990 Begue R. et al, 1992- Rosmus K. i dr .. ., 1992- Kelkar S., 1993- Unicomb L. et al., 1993 Sanchez R. et al., 1993 Broor S. et al. "1993- Dennehy P. et al., 1994).