Virološki studija. Crijevnih bolesti. (Part 3)

Svi prvog seta bili su zasnovani na "sendvič" principu, kasnije koristio "tandem" -version. U procesu izgradnje setova su razne poboljšanja i na izjavu EIA, i obradu uzoraka, a primjenjuju se tampon sistema. Na primjer, neki autori preporučuju korištenje EDTA ukloniti vanjski kapside ljuske, koji otkrije grupu kapside antigena interne. Drugi predložio uzorci obrade Eagle MEM sa 0,5% laktalbumin hidrolizata i antibiotika omogućuje da biste koristili ovu ekstrakt za otkrivanje virusa u kulturi tkiva i TEM, što ga čini moguće koristiti jedan te isti uzorak u različite metode istraživanja. Vrlo važni tampon za srednji ispiranje. Većina ovih odbojnika sastoji se od slane otopine s niskom koncentracijom deterdženta, Tween 20 (Bryden A. S., 1990). Sve setove uključuju pozitivne i negativne kontrole. Kao negativna kontrola može se koristiti kao rezerve i posebne negativne serumu. Kao pozitivna kontrola je pozitivan serumima koristi. To ipak treba napomenuti da je tumačenje rezultata varira od testa za testiranje. Primarna mjera kompleta je minimum reaktivan ili «cut-off», koji se obično koristi za određivanje pozitivan rezultat i razlika u visini između negativne kontrole i pozitivan nivo, tako idealno, optičke gustoće (OD) negativnih kontrola treba da bude <0,1. Однако на практике этот показатель колеблется у различных тестов. Что касается положительного результата, то он может быть достоверен в подавляющем большинстве случаев при показателях ОД > 0,5, т. е. в несколько раз превышает ОД негативного контроля. В то же время небольшая часть образцов слабо реагирует с ОД между «cut-off» и 0,5. Многие из них могут быть отрицательны в ПЭМ, но большая часть — положительна при ЭФ в ПААГ, ПЦР. Эти моменты необходимо принимать во внимание при проведении и учете ИФА.

Zbog velikog broja komercijalnih test sistema došlo je čitav niz radova posvećen utvrđivanje njihove relativne efikasnosti.

Treba napomenuti da je prvi komercijalni test sistemi su daleko od savršenog indeksa osjetljivost i specifičnost. Dakle, Gibchrist M. et al. (1987) na materijalu od 136 pacijenata su identificirani ove brojke za 4 ELISA test sistema: rotavirusom EIA, Pathfinder, rotavirusom Bioenzabead i Rotenzyme II, što je jednako 91%, 98%, 80%, 84% i 100%, 78%, 95 %, 88 / a, respektivno. Otkrio malu specifičnost testa sistema i Pathfinder Rotazyme II, potonji je dao lažno pozitivnih rezultata, a prema drugim autorima.

Da bi se poboljšala specifičnost testa sistema, istraživači su počeli da koriste monoklonskih antitijela. Testovi poliklonskih i monoklonskih antitijela su pokazale prednost ovom drugom. Autori grupa određuje efikasnost dva pokazatelja dijagnostički test sistemi bazirani na monoklonskih antitijela (Rotaclone, Pathfinder), i sistema zasnovanih na tri poliklonska antitijela (rotavirusom EIA, Rotazyme II, Wellcozyme rotavirusom Dennehy P. et al., 1998). U studiji uzoraka stolice od 100 pacijenata sa testiran u EF PAGE gastroenteritis, pokazalo se da je i test sistemi bazirani na monoklonskih antitijela razlikovao maksimum (100%) osjetljivost. Osjetljivosti poliklonalnih sistemi ispitivanja više od 90%, uz oscilacije specifičnosti u rasponu od 55 na 100% (Dennehy R. et al., 1988).

Flewett T. et al. (1989) od materijala iz 1163 djece (u Vol. H. 66 novorođenčadi) u odnosu dijagnostičke efikasnost sistema za testiranje Dakopatts firmi i standardni WHO test sistema. Osjetljivost i specifičnost su Dakopatts jednaka 97% u odnosu na test sistem SZO. Osim toga, u proučavanju materijala iz ove brojke test novorođenčadi test sistemi su bili 100% i 98%, respektivno.

Komparativna vrednovanje drugih ELISA test sistema: Rotascreen, Wellcozyme, Rotazyme II i Ideia pokazalo da samo Rotascreen i Ideia imao specifičnost i osjetljivost veća od 90% (Molyneaux R. J. i dr ,. 1989).

U vezi sa podacima o specifičnosti ELISA kašnjenja od svojih pokušaja da se poboljša osjetljivosti metode su napravljene koje su poboljšane ovih parametara. Komparativna studija osjetljivosti, specifičnosti i slučajnost pozitivnih i negativnih rezultata komercijalnih kitova VIDAS rotavirusom, Rotaclone Pathfinder i pod kontrolom PEM u proučavanju 464 kopromaterialov pokazao odlične rezultate: VIDAS rotavirusom 98- 99,3, 98,7 i 99% - Rotaclone - 100 - 98 99- i 100- Pathfinder - 100- 92,4- 87,3 i 100% (Dennehy R. N. et al, 1994.). Kao što se vidi iz gore navedenih podataka, komercijalni kit test kvalitativni parametri su postali toliko visoko da je broj istraživača (kao što se čini da nas je malo preuranjeno) predložio da se koristi kao referentni standard ELISA kit Rotaclone, Cambridge Biosci. Corp. (Dennehy P. H. et al., 1990). Međutim, nema više oprezni pogled na autora, za apsolutno tačne podatke, zajedno sa IFA i koristiti druge metode istrage. TEM, PCR, EF PAGE (Donneli G. et al, 1993 Husain M. et al 1995- Markowsca-. Daniel J. et al., 1996- Buesa G. et al., 1996- Dennehy PH et al., 1994 Jiang B. et al., 1995). Uprkos napretku u razvoju ELISA test sistema, da ih se poboljša istraživanje je u toku. Dakle, Ribas-Antunez M. et al. (1998) sproveo komparativnu procjenu ELISA mjesto i EF PAGE u anketi od 100 kopromaterialov uzoraka. Autori visoke osjetljivosti, specifičnosti i dogovor o rezultatima ovih metoda je dokazano.

Uz prijavu komercijalnih test sistema uspješnih pokušaja da se razvije u laboratoriju ELISA kompleti su napravljeni od strane nekoliko autora (Ruggeri F. et al., 1992- Husain M. et al., 1995- Buesa J. et al., 1996). Autorsko pravo laboratorijskim testovima na osnovni parametri nisu inferiorni u odnosu na komercijalne test sistema. Dakle, skup je dizajniran od strane indijskog Nacionalnog instituta za virusologiju (Puna) za dijagnoza rotavirus infekcije (NIV), koji je u usporedbi s komercijalnim set Dakopatts (Kelkar S. D., 1993). U postupku inspekcijskog 63 paralelnih uzoraka se da NIV otkriveno 36 zaraženih osoba (57%), Dakopatts - 33 (52%) na 100% specifičnost. Međutim, troškovi laboratorija droge bila je značajno niža nego kod drugih komercijalnih kitova koji su omogućili autori ukazuju na korištenje NIV u zemljama u razvoju.

U našoj zemlji i pokrenula proizvodnju domaćih kompleta komercijalnih test za IFA: "Rotapast" (St. Petersburg), je "Rota antigen" (Nižnji Novgorod), "Roth-analiza" (Ekaterinburg). Osjetljivost i specifičnost ovih skupova, nažalost, daje slične performanse i stranih agenata je 75%, sa slučajnost pozitivnih rezultata - 90%, negativni rezultati - 86% (Karpovitch A. G. i dr., 1991). U isto vrijeme u velikom broju laboratorija razvijene i testirane vlastite ELISA test sistema za dijagnozu rotavirusa: Bukrin AG, Vasiljev 1988- BJ et al, 1989 Ramishvili Lee L., et al., 1991. - Dzyublik IV et al, 1990 Nosatenko AI et al, 1991) ...

Prema tome, visoka osjetljivost i specifičnost, brzinu i sposobnost da se rezultati istraživanja čine automatski daju ELISA prioritet među drugim laboratorijskim dijagnostičkim metodama rotavirusa. Treba napomenuti da IFA se koristi ne samo za otkrivanje antigena, ali i za tipizaciju virusa detekcija. Takav širok spektar mogućnosti metoda čini nezaobilazan u bilo kojem laboratoriju.

Sedimentne sve dijagnostičke testove uključuju reakcije na bazi čestica aglutinacije (eritrociti, lateks, bakterije) senzibilizirani sa antigenima ili antitela koja su u stanju da agregiraju u prisustvu seruma ili homologna antigene. Čestice služe kao nosači određenih determinanti, agregacije koja se javlja kao posljedica antigen-antitijelo reakcija, koja se vizuelno evidentira prisustvo i prirode sedimenta formiran. Shodno tome, primjena testa sedimenta može otkriti kao antigena i antitijela.

Reakcija hemaglutinacija (RHA) zasniva se na sposobnosti ljudskog crvenih krvnih zrnaca, razne vrste životinja i ptica slijepljen ljudski rotavirus i životinja. Ova reakcija se koristi u početnoj fazi istraživanja i dijagnoza rotavirus infekcije (Drozdov., Et al., 1982). Novije studije su pokazale da nisu svi sojevi rotavirusa su u stanju da slijepljen eritrocita (Ezeqiel M. et al., 1995). U tom smislu, dijagnostički vrijednost ove metode je upitna i trenutno je RGZ se gotovo nikada ne koristi. U isto vrijeme, postoje izvještaji o upotrebi hemaglutinacija reakcije u istraživački karakter istraživanja u vezi utvrđivanja sposobnosti ljudskog i životinjskog Rotavirusi slijepljen eritrocita različitih grupa, kao i proučavanje uvjeta pod kojima se nalazi hemaglutinacija (Devitt SM, 1993). Nedavni radovi posvećen određenom genu proteini odgovorni za hemaglutinacija i sekvencu aminokiselina kodiranje za ovu sposobnost. Kao rezultat toga, uspeo da uspostavi hemaglutinacija domena nalazi između 93 i 203 AA VP4 (Crawford S. et al., 1994 Ezeqiel M. et al., 1995).

Reakcija indirektnih ili pasivne hemaglutinacija (PHA ili RIGA) vrlo često se koristi u laboratorijskoj praksi (posebno u maloj laboratoriji), ako je potrebno, ankete velikom broju slučajeva i brze rezultate (Kravčenko T. M. et al., 1991 Zarubinsky VY , kapa S. A., 1989- Zakirova S. F. et al., 1990 Vasil'ev J. et al., 1987.-1989 Kirin VN et al., 1991 i A. W. Abenova et al., 1991).

Za razliku od RSA, RIGA koristi u eritrocitima, osjetljivi rotavirusa antigena. Tradicionalni objekt za senzibilizaciju su ljudska crvena krvna zrnca, ovaca i peradi - kokoške, ćurke, patke. Pripremljen iz eritrocita priprema ptice nastaniti brže, čime se smanjuje analiza vremena bez gubitka osjetljivosti reakcija. Proces priključivanja antitijela na eritrocite provodi razne reagense, od kojih su najčešći su razvijač za fotografije i VDV (bidiazotirovanny Benzidin). Osim toga, upotreba imunoglobulina u senzibilizaciji eritrocita poboljšane djelotvornosti dijagnostičkih droga (Chubov N. B. et al., 1991). U našim istraživanjima, RIGA obavlja eritrocita diagnosticum tehnikom razvijen u Sverdlovsk Nieve.

Rezultati Određivanje rotavirusa u kopromaterialah pokazala da RIGA osjetljivost je 72% u odnosu na 86% u ELISA, i slučajnost rezultata pod kontrolom TEM i IEM je 100% (Vasil'yev B. J. et al., 1989). RIGA uporede rezultati sa TEM, i RSK VIEF pronađena veća osjetljivost RIGA (Tamendarova N. C. et al., 1989). Slični podaci o materijalima i od 866 djece je dobilo aplikacije RIGA, TEM i IEM (Zarubinsky VY, kapa S. A., 1989). Utvrđeno je da je osjetljivost bila ekvivalent RIGA TEM i podudarnost između ove metode je iznosila 96,6%. Usporedno rezultati kasnije Abenova W. A., et al su dobijeni. (1961). Ispitivanje 1458 kopromaterialov djecu u bolnici sa RV infekcije RIGA, DGC i TEM otkrio VIEF RV antigen 35,8- 26,2- 18,2 i 39,8% uzoraka, respektivno. Shodno tome, RIGA nastavlja se primjenjivati ​​u laboratorijske dijagnostike, ali nedostatak skladišnog-stabilne komercijalne eritrocita pripreme otežava široko koristiti za pronalaženje rotavirusa antigena u bolesnika materijala. Zajedno sa direktnim PHA u laboratoriju koristeći obrnutom metodom TPHA se koristi za određivanje RV u kulturi ćelije i kopromaterialah i trenutno (Tokieda M. et al., 1996- Kuzuya M. et al., 1998).